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Ⅰ群禽腺病毒Hexon蛋白的原核表达及间接ELISA检测方法的建立与应用
作者: 张曼 韩飞 高睿 何亚鹏
关键词: Ⅰ群禽腺病毒 Hexon蛋白 原核表达 间接ELISA
摘要：旨在原核表达Ⅰ群禽腺病毒(Fowl adenovirus group Ⅰ,FAV Ⅰ)的Hexon蛋白,并以Hexon蛋白为包被抗原建立血清的间接ELISA检测方法.将FAVⅠ群Hexon基因克隆至原核表达载体pET-28a(+)中进行重组Hexon蛋白的诱导表达,对表达产物进行纯化,并进行Westernblot鉴定;纯化后的Hexon蛋白作为包被抗原,优化反应条件,建立血清的间接ELISA检测方法,并进行特异性、灵敏性和重复性试验,最后对临床样品进行检测.结果表明,原核表达获得大小约为37.4 ku的重组Hexon蛋白;Westernblot结果表明重组蛋白有良好的特异性和抗原反应性.FAV Ⅰ间接ELISA法优化反应条件为:抗原最佳包被质量浓度为5.0mg/L,封闭条件为37℃作用1h,血清以1∶200倍稀释作用1h,酶标二抗以1∶5 000倍稀释作用lh,TMB显色时间为10 min.在该优化条件下,OD450≥0.322为阳性,反之为阴性;特异性试验结果表明,对鸡新城疫、禽流感、沙门菌、金黄色葡萄球菌、多杀性巴氏杆菌和大肠埃希菌阳性血清检测均为阴性;对阳性血清的敏感性可达1∶1 200,70份阳性血清的阳性率为97.1％;重复性试验结果表明,批内和批间OD450值的变异系数分别为1.2％～3.5％和5.1％～8.3％;用此方法对临床279份鸡血清样品检测的阳性率为51.3％.表明建立的EISA检测方法可用于FAV Ⅰ抗体水平的检测.
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